这篇AFM有点意思 || PDT治疗耐药菌感染，还可特异性识别特定病原菌！

微生物引起的感染和疾病一直是影响人类生命安全的全球性问题，尽管抗生素的问世后人类在治疗细菌感染方面取得了巨大的成功，但是由于抗生素的滥用造成的细菌耐药性问题也日益严峻，且大量使用广谱抗菌剂不分青红皂白地攻击细菌可能会导致微生物群失调等一系列严重问题。因此，开发能够特异性识别并灭活致病菌而不伤害其有益菌株的新方法目前仍然是巨大的科学挑战，并有着广阔的发展前景。

光动力疗法（Photodynamic therapy, PDT）是一种光子触发的治疗方式，产生的活性氧（reactive oxygen species, ROS）能够诱导细胞凋亡或坏死，该治疗方式不仅可以应用于肿瘤治疗，同样广泛应用于抗菌治疗，产生的ROS能够有效破坏细菌的细胞壁及膜系统，影响其新陈代谢，导致细菌死亡。

工作介绍

为了有效解决上述问题，近日新加坡国立大学刘斌教授团队以细菌为模板，通过铜催化原子转移自由基聚合反应（Atom transfer radical polymerization, ATRP）合成了具有聚集诱导发射（Aggregation-induced emission, AIE）特性的聚合物材料，并成功应用于在不伤害其他细菌菌株的情况下自选择结合和杀死特定病原菌，且不产生耐药性。由于细菌能够选择自己的结合单体，三种特定的单体被选择用于在细菌表面合成聚合物：

1. [2-(methacryloyloxy)ethyl] trimethyl ammonium chloride (TMAEMC) —永久阳离子，与带负电荷的细菌细胞表面结合。

2. AIE部分（TMAEMC-TPAPy）—在分子状态下几乎无荧光，但以聚集体的形式或与目标分析物相互作用时表现出强烈的发射。

3.[2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl)ammoniumhydroxide (DMAPS)―用于增强聚合物的溶解度，并作为结合阳离子部分之间的间隔。

由于该AIE特性的聚合物可以在细菌其表面直接合成，与特定细菌识别后在其表面聚集，从而点亮其明亮的红色荧光。不仅于此，该聚合物还可作为光敏剂，在光照射下能有效生成活性氧，通过光动力疗法高效地杀灭致病菌，该策略不仅适用于广泛的致病菌株，同样适用于临床相关的耐药菌株。该工作发表在Advanced Functional Material上，IF=16.863。

研究思路

论文导读

Scheme 1. 该论文原理图

细菌在单体催化的悬浮液中引导聚合，生成合成的胞外聚合物。在细菌表面合成的聚合物组分在水中无荧光，称为模板聚合物（templated polymer），用高盐溶液洗涤回收。由于弱相互作用，模板聚合物与不对应的细菌孵育时并不会结合到细菌表面，因此几乎没有荧光。相反，用模板聚合物与其自身的模板菌株孵育后，由于模板聚合物优异的靶向能力，能够有效识别该细菌，聚集在细菌表面，受分子内旋转的限制从而点亮其荧光。同时该模板聚合物在光照下能够产生大量ROS，通过PDT治疗能够高效杀灭致病菌。

Figure 1. 细菌模板聚合物（Bacterium-templated polymer）的合成和合成聚合物的表征。

a）TMAEC-TPAPY合成路线。

b）模板制作过程说明。E. coli- and P. aeruginosa-templated (E. coli-TP and P. aeruginosa-TP) polymers在水溶液中与MAEMC-TPAPy单体（10 × 10⁻⁶ M）孵育的c）紫外吸收光谱图和d）荧光光谱图。

e）ABDA (50 ×10⁻⁶ M) 和 E. coli-TP, P. aeruginosa-TP混合液与在MAEMC-TPAPy单体（10 × 10⁻⁶ M）不同时间白光（40 mW cm⁻²）照射下的吸收光谱。

以大肠杆菌和铜绿假单胞菌为细菌模板，成功制备了两种细菌对应的模板聚合物，即E. coli-TP and P. aeruginosa-TP。并以9,10-anthracenediyl-bis(methylene)dimalonic acid（ABDA）为ROS指示剂证明了所制备的细菌模板经白光照射后能够产生大量ROS。

Figure 2. 用细菌模板聚合物演示自选择细菌成像。

a）细菌介导的聚合物合成过程示意图。以大肠杆菌和铜绿假单胞菌为模板，指导合成细菌模板聚合物。用0.15 m NaCl洗涤，在细菌表面合成模板聚合物。

b）大肠杆菌和铜绿假单胞菌与自身匹配的模板聚合物和不匹配的聚合物孵育后的激光共聚焦成像图。

从图2中可以看出，由大肠杆菌为模板制备的E. coli-TP能够特异性结合到大肠杆菌的表面，呈现出明亮的荧光，而几乎不会与铜绿假单胞菌结合。由铜绿假单胞菌为模板制备的P. aeruginosa-TP亦展现了同样的性质。

Figure 3. 细菌模板聚合物的自选择性细菌光灭活特性。

a-d）大肠杆菌和铜绿假单胞菌的模板聚合物与对应/不对应细菌孵育后，经过黑暗和白光照明（20min, 40 mW cm⁻²）处理后的细菌活性。

e, f）在光照条件下，大肠杆菌和铜绿假单胞菌与匹配或不匹配的聚合物孵育后的形态。黄色箭头表示细菌膜的解体和融合。

g）将大肠杆菌和铜绿假单胞菌与它们匹配或不匹配的聚合物孵育后，经白光照射20 min后的活/死细菌活性测定。

所制备的E. coli-TP和P. aeruginosa-TP不仅能够特异性识别细菌，同时能够作为光敏剂，经过白光照射后产生大量的ROS有效杀灭致病菌。经PDT治疗后，大肠杆菌和铜绿假单胞菌的形态发生明显变化，表面发生变形和膜融合。通过活/死细菌荧光染色同样可以观察到相似的结论。

Figure 4. 在临床菌株存在下模板聚合物的合成及自选择成像和细菌灭活。

a） 在肺炎克雷伯菌悬浮液（BAK085和SGH10）中生长的模板聚合物的示意图，用0.15 M NaCl溶液洗涤细菌后收集模板聚合物。

b, c）进行BAK085和SGH10的自选择结合实验，激光共聚焦成像图显示在与模板聚合物孵育后，细菌表面上有强荧光，而在与非匹配聚合物孵育后，未观察到荧光信号（聚合物浓度为600 ng mL⁻¹）。

d, e）BAK085和SGH10与匹配或者不匹配的模板聚合物（2.4µg mL⁻¹）孵育后，在没有或存在白光照射（20min, 40 mW cm⁻²）的情况下，在LB琼脂上形成的BAK085和SGH10菌落的平板照片。

以临床菌株肺炎克雷伯菌（BAK085和SGH10）为模板制备的BAK085-TP和SGH10-TP通过能够得到上述的实验结果，仅能识别对应的模板细菌并在其表面点亮荧光。通过平板计数法，经过PDT治疗的实验组细菌被高效地杀灭，在LB琼脂上几乎无法形成菌落。

Figure 5. 肺炎克雷伯菌模板聚合物（BAK085-TP）对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的结合和杀灭性能。

a） 大肠杆菌和铜绿假单胞菌与BAK085-TP（600 ng mL⁻¹）孵育后的激光共聚焦成像图。

b）大肠杆菌和铜绿假单胞菌与不同浓度BAK085-TP孵育并经白光照射处理（20min, 40 mW cm⁻²）后在LB琼脂平板上形成菌落的平板照片。

基于模板聚合物优异的特异性，BAK085-TP无法与大肠杆菌或者铜绿假单胞菌结合，也不会杀灭这两种非特异性菌株。

论文亮点

1. 通过铜催化的ATRP，可以利用细菌代谢途径合成模板聚合物。

2. 合成的模板聚合物能具有优异的特异性，选择性靶向其模板细菌。

3. 引入AIE分子，使得合成的聚合物具有AIE特性，在结合到细菌表面的同时能够点亮其荧光，“turn on”的荧光开启模式十分便于区分特定的致病菌。

4. 该聚合物同时可作为光敏剂，在白光照射下可产生大量ROS，通过PDT治疗能够有效杀灭致病菌。

5. 基于上述特性，该策略能够特异性识别致病菌并灭活但不伤害其他菌株，为细菌特异性诊断和治疗应用做出了贡献。

文献链接

Guobin Qi, Fang Hu, Kenry, Kok Chan Chong, Min Wu, Yunn Hwen Gan, and Bin Liu*

Bacterium-Templated Polymer for Self-Selective Ablation of Multidrug-Resistant Bacteria. Adv. Funct. Mater., 2020, 30, 2001338. DOI: 10.1002/adfm.202001338

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